①：抗體包被  在96孔板上包被抗體。由于酶標板是由聚苯乙烯制成，其含有的苯環(huán)與抗體的氨基酸殘基具有類似π-π堆積作用的引力，結合靜電和疏水作用，可以將抗體吸附于其表面。然后，將未吸附的抗體用緩沖液清洗后，加入含有明膠或牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）的封閉液以封閉酶標板上未結合抗體的部分。加入封閉液的目的，是防止其他蛋白因靜電或疏水作用吸附在96孔板上，造成假陽性信號，干擾后續(xù)實驗的進行。

②：免疫識別  在96孔板上包被抗體后，加入待測樣，并在37°C環(huán)境下孵育一段時間，通常是1-2小時。此時酶標板上的抗體與待測抗原進行特異性識別結合。此處抗體的質(zhì)量是關鍵，好的抗體既能特異性高效地結合抗原又不受待測樣中其他生物大分子、蛋白質(zhì)和無機鹽等成分的影響。

③：洗板  將未結合的抗原洗掉，加入該抗原所對應的識別抗體并在37°C下繼續(xù)培養(yǎng)1-2小時，接著將未連接上抗原的抗體洗掉。

④：酶標信號輸出  加入帶有辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）標記的酶標二抗，用于和標準抗體結合。在培養(yǎng)30分鐘后洗掉未連接的二抗，并加入顯色劑顯色。根據(jù)顯色的結果判斷抗原的濃度。一般認為，抗原濃度與顯色后的發(fā)光強度呈正相關。

以抗原競爭抗體為例，在上述免疫夾心法操作步驟的第二步加入待測抗原后，立刻加入酶標抗原，使之與待測抗原競爭識別酶標板上的抗體。當待測抗原濃度越高，能夠連上酶標板上抗體的酶標抗體就越少，輸出的信號就越少。這樣待測樣濃度與酶顯色信號就呈逆相關。